一个新的 TBR1基因剪接变异导致的智力障碍伴自闭症和语言障碍家系分析及产前诊断

曹旭  李静  宋辉  朱媛媛

皖北煤电集团总医院产前诊断中心 ,宿州 234000

【摘要】目的探讨 1个由TBR1基因剪接变异导致的智力障碍伴 自 闭症和语言发育迟缓家系的临

床特征及基因特点 。方法对 1 例有家族史的智力障碍孕妇进行全外显子组检测 ,对先证者及其他家系成 员(共 11人) 进行分子遗传学检测 ,发现该家系的致病位点 ,对胎儿羊水进行基因检测 ,并通过 minigene技 术对该位点进行体外功能验证 。结果通过全外显子组测序发现 ,先证者携带 1 个TBR1基因新的剪接变 异( c.1129-1G>C) ,并呈现出家系共分离现象 。胎儿羊水中未发现该变异 ,胎儿出生后随访至 1 岁 ,智力 运动发育正常 。Minigene结果显示第 5外显子出现异常剪接 。结论 TBR1基因 c.1129-1G>C变异可能 是该家系的致病原因 ,及时的产前遗传诊断和咨询有助于阻断致病基因在家系中的传递 。

【关键词】TBR1基因;智力障碍伴自闭症和语言发育迟缓;剪接变异

前言

TBR1(T-box Brain1)基因编码 T-box 家族的神经元特异性转录因子 ,在有丝分裂后期谷氨酸能投射 神经元 中 表 达 ,调 控 皮 质 神经 元 的 迁 移 和 轴 突 分 化[1-3]。既往研究认为TBR1的单倍剂量不足会导致智力 障 碍 和 孤 独 症 谱 障 碍[4]。TBR1 基 因 (OMIM604616)被 OMIM 数据库收录为"智力障碍伴 自 闭症 和语言障碍,(intelectualdevelopmentaldisorderwith autism and spech delay,IDDAS)(OMIM 606053) 的 致病基因 。IDDAS是 一 种常染色体显性遗传病 ,由 TBR1基因的杂合变异引起 ,主要表现为发育迟缓/智力障碍 ,自闭症谱系障碍 ,语言发育迟缓 。 目前已有研 究发现 IDDAS也可表现为脑部结构异常( 如皮质畸 形),在不同患者中的病情严重程度差异较大[2]。本研 究中我们对一位智力障碍的孕妇及其家系进行分子遗 传学检测 ,探讨其分子致病原因 ,并对胎儿羊水进行产 前诊断 。

1 对象与方法

1.1 对象先证者 ,女 ,35岁 ,孕 3+月 。智力障碍 , 轻度自闭症 ,因智力障碍家族史接受产前诊断 ,头颅磁共振影像未见异常 。丈夫正常 ,大儿子 14岁 ,智力障碍 ,轻度自闭症 ,无一法成学完 ,语言业通困难 。先证者父母非近亲结婚 ,母亲正常 ,父亲 日 常语言交流较少 ,智力基本正常 ,行为刻板 ,不爱与人交流 。先证者祖父 、祖母未见异常 。先证者妹妹:智力障碍 ,易怒 ,自闭行为 ,生育 2 个男孩:长子 11岁 ,学习成绩差 ,智力低下 ,语言发育迟缓 ,反应慢;次子 3 岁 ,语言发育迟缓 ,反应慢 。先证者弟弟:智力障碍 ,语言业通困难 ,自闭行为 ,不育 。家系谱见图 1。先证者弟弟和妹妹婚配对象为一对亲兄妹(系谱中 Ⅲ4和 Ⅲ7 ),智力低下 ,四肢发育未见异常 ,无自闭症症状 。

1.2 方一

1.2.1 样本采集患者监护人及其家系成员均签署 了知情同意书 ,采集先证者及其家系成员(共 10人)的 外周血样本 ,EDTA抗凝 。明确致病变异后 ,孕妇丈夫 签署介人性产前诊断知情同意书 ,抽取胎儿羊水进行 分子遗传学检测 。本研究经皖北煤电集团总医院伦理 学委员会批准( WBZY-YWLCSYLL-2020-03)。

1.2.2 全外显子组测序及数据分析对先证者及其 大儿子进行全外显子组测序 。采用 QIAamp血液基 因组 DNA提取试剂盒(CatNo./ID:51104)提取外周 血样 本 中 的 基 因 组DNA,经NanoDrop2000 检 测 DNA 的浓度和纯度 。使用 Covaris M220 DNA 超声 破碎仪 ,将 DNA片段化至 150~300bp的长度范围 。 对片段化的 DNA 进行末端修复及加 A 反应 ,连接接 头后扩增 。使用 xGen○R Exome Research Panel v1.0 试剂盒(IDT)对扩增后的文库进行靶向捕获 。使用 Ilumina Novaseq 6000进行 PE150测序 。

生物信息学分析:使用 BWA将 reads 比对到人类 参考基因组(GRCH37/hg19)上[5],使用 GATK 标准 变异检测流程检测 SNP、Indel[6]。获得的变异结果用ANNOVAR进行注释[7]。在变异位点的筛选过程中 , 过滤掉 gnomAD、ExAC、千人数据库和 ESP6500数据库中等位基因频率均大于 1%的变异 。然后依次进行优先级排序 ,以研究潜在的有害变异 。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American Colege ofMedical GeneticsandGenomics,ACMG)遗传变异分类标准 与指南进行变异位点的分类[8]。

1.2.3 Sanger测序及家系分析其他家系成员及羊 水样本采用 Sanger测序进行位点验证及分析 。全外 显子组测序检测到TBR1基因上的 一 处可能致病的位 点"NM006593.2:c.1129-1G>C",采用 Primer5引 物设计软件在该变异的上下游区域设计引物:F:5'- CCTTTCCACTCAATCCCTCA-3';R:5'-AAAGCC- CAATTCCACAGCTA-3',目的产物长度 270 bp。引 物由生工生物工程( 上海)有限公司合成 ,以基 因 组 DNA为模板 ,使用 TaqDNA 聚合酶(TaKaRa)扩增 。 PCR产物纯化后 ,使用 ABI3730xl测序仪进行双向测 序 。所有家系成员的 Sanger测序结果使用 Chromas 软件进行分析 ,并与正常序列(NM006593.2)进行比 对 ,分析其基因型 。

1.2.4 Minigene 试 验 设 计 两 对 巢 式 引物 2588- TBR1-F和5009-TBR1-R,2803-TBR1-F和4740- TBR1-R( 表1),以 基 因 组 DNA 为 模 板 进 行 巢 式PCR。以巢式 PCR第二轮的产物为模板用 pcMINI- TBR1-KpnI-F 和 pcMINI-TBR1-BamHI-R 为引物扩增得到 pcMINI野生型片段 860 bp。 以巢式 PCR第二 轮 的 产 物 为 模 板 用pcMINI-TBR1-KpnI-F 和TBR1-MUT-R 为 引物 扩 增 得 到 变 异 型 片 段1,用TBR1-MUT-F 和pcMINI-TBR1-BamHI-R 为 引物扩增得到突变型片段 2,将片段 1 和片段 2 以 1 : 1 混合 。 pcMINI-TBR1-KpnI-F和 pcMINI-TBR1- BamHI-R 为引物扩增得到 pcMINI变异型片段 860 bp。载体 pcMINI和片段进行酶切 ,回收 ,连接 ,转化 , 菌落 PCR 鉴定以及测序 。表 1 载体构建所用引物

2 结果

通过全外显子组测序结果发现 ,先证者及其大儿子 均携带一处TBR1基因的杂合变异 c.1129-1G>C,位于 第4内含子和第5外显子的经典剪接区域(PVS1)。该图 1 家系图谱图 2 家系 Sanger测序图 TBR1基因检测结果为野生型:先证者祖法( I 1)、祖父( I2 )、父亲( Ⅱ 2 )、丈夫( Ⅲ1 )、胎儿羊水( Ⅳ2 ); TBR1基因检测结果为 c.1129-1G>C:先证者( Ⅲ2 )及其大儿子( Ⅳ1 )、先证者的法亲( Ⅱ 1 )、先证者的妹妹( Ⅲ5 )及其小儿子( Ⅳ4 )、先证者的弟弟 ( Ⅲ6)图 3 Minigene结果图3A:minigene构建测序图 ,上为 wt(野生型),下为 mut(突变型);3B:逆转录-PCR转录分析胶图;在 293T和 MCF-7 细胞中的存在差异性条带分别标为 a、b、c;3C:minigene构建策略及剪接示意图;3D:剪接条带对应测序结果图 。红 * 表示突变位置变异未在 gnomAD、ExAC、千人和 ESP6500等人群频

率数 据 库 的 正 常 人 群 中 发 现 ( PM2)。HGMD 和ClinVar数据库中未见报道 。dbscSNV 软件( ADA:0.9999;RF:0.934)预测该位点影响剪接 ,GERP软件(NR:5.25;RS:5.25)预 测 该 位 点 具 有 高 度 保 守 性(PP3)。

通过对家系中其他成员的 Sanger测序结果(图 2)和临床表型分析发现 ,先证者表型正常的祖法( I1 )、

祖父( I2 )、父亲( Ⅱ2 )和丈夫( Ⅲ1 )皆未发现变异 。先证者法亲( Ⅱ 1 )携带新发的 c.1129-1G>C变异 ,智力正常 ,仅表现为轻微的社交障碍 ,语言交流较少 ,行为刻板 。先证者的妹妹( Ⅲ5 )及其小儿子( Ⅳ4 )、先证者的弟弟( Ⅲ6 )皆携带此变异 ,并表现出不同程度的智力障碍 、自闭行为和语言障碍 。该变异与疾病在家系中共分离(PP1)。根据 ACMG 遗传变异分类标准与指南 ,该变异等级评定为"致病"(PVS1+PM2+PP1+PP3)。胎儿羊水样本未见 c.1129-1G>C变异 ,出生后随访至 1 岁 ,智力 、运动发育正常 。

Minigene实验结果:逆转录-PCR 检测结果显示 在 293T和 MCF-7 细胞中野生型有 1 条预期大小的 条带 ,命名为条带 a(457bp)。变异型有 2条比野生型 略小的条带 ,分别命名为条带 b、c,将条带 a、b 和 c送 测序 。测序结果显示:条带 a为正常剪接条带 ,其剪接 方式为 ExonA- Exon5(62bp)-ExonB;条带 b 为异常 剪 接 条 带 ,其 剪 接 方 式 为ExonA-△Exon5p 19bp (43bp)-ExonB;条带 c为第 5外显子跳跃 ,即第 5外显子缺失 ,条带 c 的剪接方式为 ExonA- ExonB(图 3)。

3 讨论

TBR1是脊椎动物胚胎发育过程中的 一 个重要转基因变异均为新发变异 。这些变异位点在TBR1基因 上散在分布 ,未发现热点致病区域 。本研究中我们发 现的 1 个TBR1基因剪接变异 c.1129-1G>C导致的 IDDAS家系尚未见报道 。c.1129-1G>C位于TBR1 基因第 4 内含子和第 5 外显子的经典剪接区域 ,破坏 了"GT-AG"剪 接 位 点 的 结 构 。该 变 异 预 测 会 导 致TBR1基因在转录过程中不能正确的识别第 5 外显子的位 置 ,导 致 剪 接 错 误 。Minigene 试 验 结 果 显 示: c.1129-1G>C引人了 2 种新的剪接模式 ,第 5 外显子左侧缺失 19bp或者第 5外显子跳跃 ,影响TBR1基因的转录 。既往研究证明 ,TBR1基因的单倍剂量不足是 IDDAS的致病机制 ,移码变异 、无义变异和错义变异的 致 病 病 例 均 有 报 道 。 我 们 报 道 的 剪 接 变 异c.1129-1G>C 扩 展 了TBR1基 因 变 异 谱 。Nambot 等[141对 25个携带TBR1基因变异患者的表型分析发现 ,所有的患者都表现为中重度智力障碍 ,70%的患者表现出 自闭行为 ,28%的患者没有语言障碍 ,其余则表现为严重的语言发育迟缓 。在我们报道的家系中 ,有6 例 携 带c.1129-1 G>C变 异 的 患 者 ,其 中4 例 (66.67%)表现为重度智力障碍合并重度自闭症行为 , 2例(33.33%)表现为轻度 自 闭行为 ,不与他人接触 目光 交 流 及 主 动 语 言 交 流 ,智 力 基 本 正 常 。 4 例 (66.67%)表 现 为 严 重 的 语 言 发 育 迟 缓 ,1 例 (16.67%)患者有攻击性行为异常 。其中 ,先证者的父亲( Ⅱ1 )携带新发的 c.1129-1G>C,但未表现出明显的神经系统症状 ,脑部磁共振影像也未见异常 ,日常语言交流较少 ,智力基本正常 ,行为刻板 ,不爱与人交流 , 有轻度自闭症行为 。我们推测TBR1基因可能存在表现度不同的现象 ,具体的表现度需要更多样本量的观察统计 。我们对胎儿羊水进行了 Sanger测序 ,未检测到TBR1基因 c.1129-1G>C,出生后随访至 1 岁 ,智力运动发育正常 ,后续将继续随访该家系的情况 。

总结

综上所述 ,我们报道了 1个具有不同程度的智力障 碍 、自闭症和语言障碍的家系 ,通过全外显子组测序和 Sanger测序在该家系的 TBR1基因中检测到 1 个新的 剪接变异 ,拓宽了TBR1基因变异谱 ,并发现TBR1基因 存在表现度不同的现象 。为受累的家庭提供了产前诊 断和遗传咨询 ,有利于降低出生缺陷的发生 。