​肥胖主效基因SH2B1与孤独症谱系障碍认知社交功能的关联研究

李晨蕊'，李齐'，张延承七李想I,于迪I,石雅馨'，范莉莉'，武丽杰'

1.哈尔滨医科大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学教研室，黑龙江哈尔滨150081；2.哈尔滨市第一专科医院

【摘要】：目的研究肥胖主效基因SH2B1与孤独症谱系障碍(ASD)认知和社交功能的关联，为ASD病因学研究提供思路。方法应用动物行为学实验和转录组测序技术，比较BTBR小鼠(«=6)与对照小鼠3=6)认知、社交水平差异及SH2B1基因表达水平的差异。构建SH2B1基因敲除小鼠(SH2BH-小鼠)3=6),比较其与对照小鼠之间认知水平及社交功能的差异，并使用Western-Blot实验探究SH2BV-小鼠海马组织中认知相关蛋白磷酸化水平的改变。结果BTBR小鼠较对照小鼠认知水平显著降低(P<0.05),社交能力显著下降(P<0.05).SH2B1基因表达水平下调0.05)。SH2B1--小鼠较对照小鼠表现出认知水平降低(P<0.05)以及社交功能损害(PC0.05)。SH2B1~-小鼠认知相关蛋白CREB和CaMKU瞬酸化水平低于对照组小鼠，差异有统计学意义(z=2.74.3.62,P<0.05)„结论SH2B1基因可能与ASD认知和社交功能损伤高度相关。

【关键词】：孤独症谱系障碍；SH2B1；认知；认知相关蛋白；社交障碍

中图分类号:R749.94 文献标识码：A 文章编号：1008-6579(2021)09-0960-05

基金项目：国家自然科学基金(8187120715)

作者简介：李晨蕊<1994-),女.山西人，硕士在读，主要研究方向为儿童发育障碍及行为问题。

通信作者：武丽杰

前言

孤独症谱系障碍(autismspectrumdisorder,ASD)是一种神经发育障碍性疾病，其核心症状包括社会沟通和社会交往缺陷以及局限、重复的行为、兴趣或活动多项研究显示，ASD儿童肥胖发生率均高于正常对照儿童口七此外，与患有其他发育障碍性疾病如注意力缺陷多动障碍、学习障碍的儿童相比，ASD儿童的肥胖检出率也较高3。本课题组前期研究发现，按照体重指数、体脂率、腰围（waistcircumference,WC）的评价标准，ASD儿童的肥胖检出率均高于正常儿童'句。SH2B衔接蛋白1[Srchomology2（SH2）Badaptorprotein1,SH2B1]基因被公认为是肥胖的主效基因逍，对控制机体能量和葡萄糖稳态至关重要。除与肥胖的发生密切相关之外，亦有研究报道，SH2B1基因变异与神经系统的发育异常存在显著关联,可能岀现脑发育迟缓、社交孤立、攻击性行为等症状氈叽本课题组前期通过焦磷酸测序证实，SH2B1基因Chr.16：28856743位点甲基化水平在ASD儿童和正常儿童之间存在显著差异口°」。综上，推测SH2B1基因可能与ASD认知和社交功能损伤密切相关。本研究通过动物行为学实验和转录组测序技术，探究ASD模型鼠（BTBR鼠）认知、社交损伤和SH2B1基因表达水平的关联性，并通过构建SH2B1基因敲除鼠，进一步验证SH2B1基因对认知和社交功能的影响，探究肥胖主效基因SH2B1与ASD认知社交损伤的关联。

1对象和方法

1.1对象BTBRT+tf/J（简称BTBR）小鼠釆购于南京大学模式动物研究所，许可证号为201701134。C57BL/6C简称C57）小鼠采购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2019-0002,由北京维通达生物技术有限公司进行SH2B1基因敲除。获得雌雄SH2B1+/杂合型C57小鼠，饲养1周后合笼并对其后代进行基因型鉴定。实验鼠选用雄性SH2Brf-纯合型C57小鼠、雄性BTBR小鼠作为实验组，选用雄性C57小鼠作为对照组。实验动物饲养于哈尔滨医科大学SPF级动物房，饲养环境温度（22+2）°C,湿度（50+10）%,光照、饲养环境符合卫生标准。

1.2方法

1.2.1行为学实验P35采用YH-HB三箱实验系统评估小鼠社交行为。实验装置为被透明隔板分为三个箱格的一长方体箱体（60cmX40cmX20cm）,三个箱格之间均允许小鼠自由出入，测试环境相对安静，自然光源。系统自动记录被测鼠运动轨迹和在三个箱格内的停留时间。P36-P40采用WMT-100Morris水迷宫系统评估小鼠认知水平，由一个圆柱形水槽（直径120cm,深55cm）和视频采集系统组成，水槽四周用遮光布包围。在第一象限中心放置一个圆形平台，使平台隐藏于水面以下1cm。在遮光布四个象限分别贴上色彩鲜明、形状不同（三角形、圆形等）的标记物。定位巡航实验阶段需要记录被测鼠从第三象限入水点放入水中60秒内找到平台所用的时间，记为逃避潜伏期。定位巡航实验每天上午下午各进行1次，时间固定，连续进行4天。第5天，进行空间探索实验，移除平台后将被测鼠从第三象限入水点轻轻放入水槽，记录60秒内其在原平台区域的穿越次数。

1.2.2RNA-SeqP41取各组小鼠海马组织，并提取总RNA,进行polyA-RNA富集方式建库测序（IlluminaHiSeqXTen,双末端），得到测序原始数据。采用Trimmomatic软件对原始数据进行质量预处理（处理参数：默认），通过运行Hisat2、String-tie2软件进行基因组比对及读取岀每个基因的FP-KM表达值（参考基因组为：mmlO）。

将所有测序样本FPKM表达数据进行矩阵合并，利用R软件包"siggenes”中的SAM检验方法计算出差异表达的基因，其中显著差异基因的阈值为差异倍数＞2或F值＜0.05。

1.2.3Westernblot实验P41提取小鼠海马组织，采用Western-Blot实验检测小鼠海马组织中认知相关蛋白CREB、CaMKH表达及其磷酸化水平。

1.3统计学方法使用SPSS23.0进行数据分析。不同组小鼠基因表达水平比较釆用独立样本t检验;社交能力和偏好时间比较釆用配对f检验，定位巡航实验潜伏期比较采用Mann-witneyU检验，空间探索实验潜伏期、有效区域运动时间、有效时间运动次数、逃逸平台滞留时间、逃逸平台进入次数比较采用U检验;海马组织蛋白表达水平比较使用独立样本Z检验。检验水准a=0.05。

2结果

2.1BTBR小鼠认知、社交水平检测结果选取雄性BTBR小鼠（»=6）和对照组C57小鼠（〃=6）,通过水迷宫实验检测其认知功能，通过三箱实验检测其社交功能，结果证实BTBR鼠在认知和社交功能上存在损伤。

2.1.1BTBR小鼠与对照组小鼠认知水平比较定位巡航实验发现-BTBR组小鼠逃避潜伏期较对照组小鼠明显延长（第三次训练60.10+5.85vs.27.60士27.18,7=34.00,P=0.009）；空间探索实验中，同对照组小鼠相比，BTBR组小鼠逃避潜伏期延长，但差异无统计学意义（41.35土39.45vs.

12.80±52.60,Z=26.00,F=0.240）,有效区域进入次数明显减少（1.00+1.25vs.3.00+4.00,7=

3.50,P=0.015）,有效区域运动时间明显降低（0.40士0.55vs.1.35士2.00,Z=4.00,P=0.026）。见图1。注：*P<0.05,"P<0.01o图1BTBR小鼠和对照小鼠定位巡航潜伏期、空间探索潜伏期、有效区域进入次数和运动时间的比较2.1.2BTBT小鼠与对照组小鼠社交能力及偏好比较社交能力测试阶段，对照组小鼠探索陌生鼠1的时间显著大于探索空笼子的时间(178.99+47.44vs.64.54±20.07,/=8.51,PV0.001),而BTBR组小鼠探索陌生鼠1的时间与探索空笼子的时间差异无统计学意义(118.92+60.80vs.32.53+31.62,7=2.49,F=0.055)；社交偏好测试阶段，对照组小鼠探索陌生鼠2的时间显著大于探索陌生鼠1的时间(137.25+46.57vs.67.81+42.88”=

3.97,F=0.011),而BTBR组小鼠探索陌生鼠2的时间与探索陌生鼠1的时间差并无统计学意义(56.54+33.52vs.47.30+33.21,?=0.43.P=0.687)0见图2。注：*P<0.05,-P<0.01图2BTBR小鼠和对照小鼠社交能力和社交偏好的比较

2.2BTBR小鼠与对照组小鼠SH2B1基因表达水平比较为进一步探究ASD模型鼠认知和社交损伤与SH2B1基因的相关性，对两组小鼠海马组织RNA进行测序，使用Hisat2、StringTie等软件进行表达丰度读取，并使用siggenes软件包对两组小鼠海马组织中SH2B1基因表达水平进行比较。结果显示，与对照组小鼠相比，BTBR小鼠海马中SH2B1基因表达明显下调(差异倍数=0.51)(P<0.05)。见图3O

2.3SH2B1基因与认知和社交损伤的关联分析为进一步证实SH2B1基因与认知、社交损伤的关联性，本研究又构建了SH2B1基因敲除鼠(SH2B1 鼠)，并通过行为学和Western-Blot的方法证实SH2B1基因与认知和社交损伤的关联性。

2.3.1SH2B1 小鼠认知水平检测SH2B1

小鼠(n=6)和对照组小鼠(〃=6)水迷宫测试结果，图3SH2B1基因表达量热图。见图4。在定位巡航实验中，SH2B1•组小鼠的逃避潜伏期较对照组小鼠明显延长(第一次训；第三次训；第六次训练,表明敲除SH2B1基因使小鼠学习能力下降；在空间探索实验中，同对照组小鼠相比，SH2B1-/-组小鼠逃避潜伏期明显增加(60.10+0.50vs.12.80+52.60,Z=32.00,P=0.026),逃逸平台进入次数明显减少(0.00+0.25vs.2.00+5.00,Z=4.00,P=0.026),逃逸平台滞留时间明显降低,表明SH2Brz-小鼠记忆功能受损。注，P<0.05,,,P<0.01。图4SH2B1-'-小鼠和对照小鼠定位巡航潜伏期，空间探索潜伏期、逃逸平台进入次数和滞留时间的比较。

2.3.2SH2B1-—小鼠社交能力检测社交能力测试阶段，对照组小鼠探索陌生鼠1的时间显著大于探索空笼子的时间(178.99+47.44vs.64.54+20.07,f=8.51,P<0.001),而SH2B1--组小鼠探索陌生鼠1的时间与探索空笼子的时间差异无统计学意义(64.64+30.28vs.20.50+19.23,t=2.25,P=0.075)；社交偏好测试阶段，对照组小鼠探索陌生鼠2的时间显著大于探索陌生鼠1的时间(137.25+46.57vs.67.81士42.88,Z=3.97,P=0.011),而SH2B1，组小鼠探索陌生鼠2的时间与探索陌生鼠1的时间差异无统计学意义(41.45士44.91vs.34.35±2&18,£=—0.28,P=0.792)O表明SH2Br/-小鼠存在明显的社交功能损伤。见图5。注：*PV0.05,**P<0.01o图5 小鼠和对照小鼠社交能力和社交偏好的比较2.3.3SH2B1-—组小鼠海马组织认知相关蛋白磷酸化水平检测SH2B1-—小鼠海马组织中CREB和CaMKII磷酸化水平均低于对照组小鼠，差异有统计学意义(CREB：1.08±0.23vs.1.38+0.14/=2.74,P=0.021；CaMKH0.65±0.11vs.0.89+0.13u=3.62,F=0.005),结果表明SH2B1基因缺失鼠存在明显的认知蛋白功能损伤。见图6。

3讨论

3.1SH2B1基因可能与ASD儿童社交和认知障碍ASD通常起病在幼儿期，除社交缺陷和刻板行为这两个核心症状之外，还常伴发智力障碍、肥胖等共患疾病：美国孤独症和发育障碍监测系统(AutismandDevelopmentalDisabilitiesMonito-ring,ADDM)最新公布的数据称,40%ASD女童和33%ASD男童存在智力障碍「⑴。已有许多研究表明，各个年龄段中ASD患者的肥胖检出率高于正常人群。

SH2B1基因是公认的肥胖主效基因，已有文献报道,SH2B1基因的缺失、微缺失、错义突变、移码突变等变异与人类肥胖的发生密切相关[12'14]o2012

年,一项针对早发性肥胖患者进行的调査研究发现,携带SH2B1突变的肥胖者在表现出食欲亢进，胰岛素抵抗和儿童期肥胖症状的同时，还表现出一系列的行为异常：社交孤立和攻击性行为应。这种社交和行为异常在动物模型中也得到验证，特异性沉默小鼠大脑中SH2B1基因的表达会导致小鼠出现大脑发育迟缓和攻击性行为⑴。

本课题组前期对5对同卵非共患双胞胎和30对散发ASD儿童-正常对照儿童进行全基因组DNA甲基化分析，发现SH2B1基因的Chr.16：28856743位点在病例组和对照组中存在显著差异「国；亦有研究报道，一个家庭的3个ASD儿童中均携带SH2B1基因变异，并表现出不同程度的智力障碍m〕。2021年，研究者在澳大利亚ASD生物数据库同样发现了SH2B1基因拷贝数变异卩句。结合相关文献和前期工作中的发现，提示肥胖主效基因SH2B1在ASD的某些病理生理过程中起了重要作用，可能与ASD儿童的社交缺陷、智力缺陷以及肥胖高发密切相关。

BTBR小鼠是一种近交系小鼠，可以稳定表现出ASD核心症状：低下的社会交流能力、受限重复的行为模式，是公认的研究ASD病理生理表现及机制的天然动物模型本实验也证实BTBR小鼠存在认知和社交障碍，并通过转录组测序技术对其海马组织RNA进行测序，结果显示BTBR小鼠的SH2B1基因表达明显下调，这与课题组前期人群研究发现相近。提示肥胖主效基因SH2B1与ASD社交和认知障碍密切相关。

3.2SH2B1基因影响ASD儿童认知及社交功能的机制本研究结果显示SH2B1基因敲除小鼠认知和社交功能存在明显损伤，提示SH2B1基因影响认知和社交功能，与2012年Doche等'时进行的人群研究结果相符。有文献报道，SH2B1蛋白能够影响大脑发育进程,SH2B1基因敲除小鼠的大脑重量与野生型小鼠相比显著降低，其梨状叶和杏仁核中的神经元总数显著减少，导致3周龄内的小鼠大脑发育迟缓，而恢复SH2B1基因表达水平则可以使大脑发育恢复正常⑴。上述结果均提示SH2B1基因可能通过影响生命早期中枢神经系统发育进而影响个体认知水平，但具体机制仍未阐明。

人和动物的海马结构内部存在多种与认知功能相关的神经细胞。环磷腺昔效应原件结合蛋白(cAMP-responseelement-bindingprotein,CREB)和钙调素依赖蛋白激酶U(calmodulin-dependentproteinkinaseILCaMKH)与小鼠学习、记忆能力密切相关，于海马神经元内功能活化可以提高小鼠认知水平。抑制CREB蛋白的磷酸化会导致个体记忆功能损伤，相反.CREB蛋白活性增加，记忆功能也会随之增强此外，也有发现CaMKH蛋白在记忆储存中具有关键作用本研究中，与对照小鼠相比,SH2Br-小鼠海马组织内P-CaMKD/CaMKH与p-CREB/CREB比值均显著下降，这与Morns水迷宫实验结果相一致，提示SH2B1基因缺失导致小鼠海马内CREB和CaMKH功能受到抑制，进而导致小鼠认知功能损伤。

总结

综上所述，ASD的病因仍未完全阐明，其临床表型和遗传机制都具有高度异质性。本研究应用ASD模型鼠探究SH2B1基因与ASD认知和社交损伤的关联，但由于获得SH2B1基因缺失的ASD模型鼠时间长，难度较大，所以本研究未能验证SH2B1--BTBR小鼠的认知和社交功能改变，在下一步的研究中，将扩大动物模型样本量、收集SH2B1基因敲除ASD模型鼠多方面进行验证，阐明肥胖主效基因SH2B1对ASD认知和社交功能的影响及机制。