小儿黄龙颗粒对注意力缺陷多动障碍大鼠的干预作用及机制研究

伍永鸿1刘嘉琦1田骄1欧文静1黄喜燕1高佳慧1黄日康1张硕峰1
                    (1.北京中医药大学中药学院,北京102488)
                

【摘要】：目的 研究小儿黄龙颗粒对注意力缺陷多动障碍（ADHD）模型动物的干预作用及作用机制。方法 采用幼龄自发性高血压大鼠（SHR）作为ADHD模型大鼠，将32只健康SHR大鼠按体重随机分为4组，即SHR大鼠组，小儿黄龙颗粒1.88、3.75 g·kg-1组，哌甲酯组，另设WKY大鼠组、Wistar大鼠组，每组8只，连续灌胃给药21 d。以自主活动度、焦虑程度、社交偏好程度、易激惹程度、空间记忆能力、注意定势转移能力作为ADHD行为学指标；以超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS/MS）方法检测大鼠大脑内前额叶中多巴胺（DA）、高香草酸（HVA）的含量；以PCR方法检测大鼠前额叶内酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）m RNA的表达量。结果 3.75 g·kg-1小儿黄龙颗粒可改善ADHD模型大鼠的行为学异常，显著提高大鼠前额叶DA含量（P <0.01）、降低HVA含量（P <0.05），明显促进前额叶TH m RNA、DAT mRNA的表达（P <0.01）。结论 小儿黄龙颗粒能改善ADHD模型大鼠的行为学障碍，其作用机制与改善多巴胺能神经功能有关。
【关键词】：注意力缺陷多动障碍小儿黄龙颗粒神经递质行为学
中图分类号：R285文献标识码：A文章编号：1672-2981(2023)07-1738-06

基金:国家自然科学基金面上项目（No.81973492）
作者简介:伍永鸿，男，在读硕士研究生，主要从事中药神经药理学研究，
张硕峰，男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事中药药理学研究，

前言

注意力缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）是常见的儿童神经发育性疾病之一，其三大核心症状为注意力不集中、活动过度和行为冲动。本病在全球内的患病率约为5%，而在我国儿童及青少年中的患病率为4.9%～6.6%[1]，且近年患病率有递增的趋势。针对本病，目前临床以哌甲酯、托莫西汀等作为一线用药，但其具有潜在成瘾性，且易诱发抽动、食欲抑制等情况[2]，临床应用具有一定的局限性。
小儿黄龙颗粒是目前唯一一个由国家食品药品监督管理局批准的治疗ADHD的中成药。在陈瑶[3]的研究中发现，ADHD患儿在使用6周小儿黄龙颗粒治疗后，口干咽燥、手足心热、盗汗、失眠多梦及大便秘结积分均显著降低；武金霞等[4]发现小儿黄龙颗粒治疗ADHD的有效率高达97.44%。但目前存在的问题是，小儿黄龙颗粒改善患儿行为障碍的作用特点尚不清晰，关键机制尚不明确。
为了进一步观察小儿黄龙颗粒治疗ADHD的作用特点，本研究通过检测模型大鼠前额叶单胺类神经递质多巴胺（dopamine,DA）及其代谢物高香草酸（homovanillic acid,HVA）的含量，并以DA合成关键因子酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）及再摄取关键因子多巴胺转运体（dopamine transporter,DAT）为切入点，探讨小儿黄龙颗粒对ADHD的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物
SPF级SHR大鼠32只，雄性，2周龄，体质量45～60 g;SPF级同源正常血压大鼠（Wistar-kyoto,WKY）大鼠8只，雄性，2周龄，体质量45～60 g;SPF级Wistar大鼠8只，雄性，2周龄，体质量45～60 g[斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2019-0010。动物合格证号分别为，SHR大鼠：110324211105414141、11032411106224726、110324211107114176、110324221101360268,WKY大鼠：1100112111117 3 9 1 3 6、11 0 0 11 2 1111 3 6 3 3 11 2,Wi s t a r大鼠：11032411105414438、110324211106224824、110324221100380874、110324221101959716]。室温为（23±2）℃，相对湿度为（65±5）%，给药前使动物先适应性饲养2 d，自由摄取食水，并且实验过程中对动物的操作符合医学动物伦理学标准。
1.2 试药
小儿黄龙颗粒（重庆希尔安药业有限公司，规格：5 g/袋，批号：201002）。临床用量：6～9岁，一次一袋，一日两次；10～14岁一次两袋，一日两次。按12岁体质量32 kg计算，用量为0.156 25 g·kg-1，大鼠剂量按照人用量的6、12倍计算，即1.88、3.75 g·kg-1）。盐酸哌甲酯缓释片（西安杨森制药有限公司，规格：36 mg，批号：0KE654），临床用量为36 mg，服用年龄为6～12岁，故按12岁体质量32 kg计算，用量为1.125 mg·kg-1，大鼠剂量按人用量的6倍计算，即6.75 mg·kg-1。戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号：020402）。总RNA提取剂（批号：94604,Ambion）；三氯甲烷（批号：20150282，北京试剂）；异丙醇（批号：C12499815,Macklin）；乙醇（批号：2110211025,JING CHUN）；无酶水（批号：SL311437100,Coolaber）；逆转录试剂盒（Novo Script RPlus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(g DNA Purge，批号：05227808）、q PCR试剂盒（Novo Start RSYBR qPCR SuperMix Plus，批号：05229413)(Novoprotein）；多巴胺（纯度：98%，批号：S14GB161091）、高香草酸（纯度：98%，批号：N16GB168232）、去甲肾上腺素（纯度：99%，批号：H20N11C130929）、5-羟色胺（纯度：98%，批号：F25F7E10127）、5-羟吲哚乙酸（纯度：98%，批号：J14HB187275）、2-吡啶乙酸盐酸盐（纯度：97%，批号：A16D10S105869）（源叶生物）；3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（纯度：98%，批号：2-ACH-121-4,TRC）；甲酸（批号：20170220）、乙腈（批号：F22M51202）（天津市福晨化学试剂厂）。
1.3 仪器
AR1140/C型电子分析天平（上海奥豪斯公司）；Ethovision XT 9.0动物行为跟踪仪（荷兰Noldus公司）；5810R高速常温/冷冻离心机（德国艾本德公司）；Milli-Q型超纯水系统（北京五洲东方科技发展有限公司）；ND one超微量紫外可见分光光度计（美国Thermo公司）；Step One Plus R实时型定量PCR仪（美国ABI公司）；液相-质谱联用分析系统（LC-MS/MS)Ac Quity UPLC系列液相仪、UPLC系统工作软件Empower（美国Waters公司）；API 5500 Qtrap质谱仪、质谱仪系统工作软件Analyst 1.62（美国AB Sciex公司）；-70℃超低温冰箱（中国Haier集团公司）；台式离心机（德国Thermo Fisher公司）；T18 Basic高速分散机、Vibrax VXR小型摇床、MS3 Basic涡旋混合器（德国IKA公司）；注意定势转移测试箱（中国阔云仪器设备有限公司）。

2 方法

2.1 分组与给药
将SHR大鼠按体质量随机分为4组，每组8只，即SHR大鼠组，小儿黄龙颗粒1.88、3.75g·kg-1组，哌甲酯组，另8只WKY大鼠为一组，8只Wistar大鼠为一组，用作SHR大鼠的正常对照组。小儿黄龙颗粒1.88 g·kg-1组和小儿黄龙颗粒3.75 g·kg-1组灌胃小儿黄龙颗粒溶液，每日两次，哌甲酯组给予盐酸哌甲酯缓释片6.75 mg/（kg·d），连续21 d，其余各组灌胃等量生理盐水。
2.2 观察指标
2.2.1 自主活动程度
在给药第16日晚8:00进行大鼠自主活动的检测，实验时，将大鼠放入旷场实验箱中（44 cm×44 cm×54 cm），首先适应环境1 min，再观测30 min。所得视频文件用Noldus动物行为跟踪仪EthoVision XT 9.0软件进行分析。分别记录每只大鼠的行为学指标（移动总距离、移动速度、中心区域时间、中心区域路程、活动连续性）。
2.2.2 社交偏好程度
在给药第17日20:00将大鼠放入三箱社交装置箱中进行社交偏好实验，提前将陌生鼠放入装置的一侧，另一侧不放入大鼠作为空白侧。实验时，使动物首先适应环境1min，再观察30 min。检测指标：待测动物陌生鼠侧区域时间，以及陌生鼠侧区域时间百分比。
2.2.3 易激惹程度
给药第20日进行激惹实验，通过测量攻击性反应来检测类似易怒的行为，其具体操作和统计方法详见参考文献[5]。
2.2.4 注意定势转移能力
给药第19～21日进行注意定势转移任务（AST）测试，为维持动物保持一定的饥饿状态，将给食量控制在正常食量的70%左右。AST测试具体操作方法及程序详见参考文献[6]。
2.2.5 空间记忆能力
巴恩斯迷宫实验分为学习过程（第16～18日）和检测过程（第19日），期间以光刺激作为驱动小鼠进入目标洞口的动机，其具体训练方法与检测方式详见参考文献[7]。
2.2.6 Real-time PCR检测前额叶皮质TH mRNA、DAT mRNA表达
按实验操作步骤提取前额叶总RNA，分析纯度、检测浓度后逆转录，96孔板加样，离心10 min，注意避光，放入荧光PCR仪进行荧光定量PCR实验，扩增条件：保持阶段：95℃10 min；循环阶段：95℃20 s,60℃1 min，循环40次；溶解曲线阶段：95℃15 s,60℃1 min,95℃15 s。描绘溶解曲线，重复3次，对CT值进行统计分析。引物序列见表1。
表1 实时荧光定量PCR引物序列
2.2.7 UPLC-MS/MS检测大鼠前额叶内单胺类神经递质DA及其代谢物HVA含量
将大鼠前额叶按质量加入4倍质量超纯水匀浆，保存于-70℃冰箱备用。精密吸取组织匀浆液100μL，加入300µL甲醇（含0.1%甲酸），3000 r·min-1涡旋5min，冰水浴超声5 min,12 000 r·min-1离心5min后，取上清液300μL在真空浓缩仪中吹干，然后加入100μL复溶溶液（初始流动相比例），3000r·min-1涡旋5 min，冰水浴超声5 min,12 000r·min-1离心5 min后，取上清液进样5μL分析。色谱检测条件、质谱检测条件及具体操作方法详见参考文献[8]。

3 结果

3.1 对ADHD模型大鼠自主活动的影响
结果如表2所示，SHR大鼠的移动总距离、移动速度、活动连续性均明显高于Wistar大鼠（P<0.01);WKY大鼠与Wistar大鼠各指标无明显差异，提示幼年SHR大鼠具有多动、焦虑的特性。与SHR大鼠组相比，小儿黄龙颗粒（3.75g·kg-1）可显著降低SHR大鼠的移动总距离、移动速度和活动连续性（P<0.01）；小儿黄龙颗粒组（1.88 g·kg-1）对其改善程度降低；哌甲酯能显著降低SHR大鼠的活动连续性（P<0.05），其余各指标差异均无统计学意义。
表2 小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠自主活动的影响()
注：与SHR大鼠组相比，*P<0.05,**P<0.01；与Wistar大鼠组相比，#P<0.05,##P<0.01。
Note:Compared with the SHR rat group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the Wistar rat group,#P<0.05,##P<0.01.
3.2 对ADHD模型大鼠社交能力的影响
结果如表3所示，SHR大鼠、WKY大鼠各指标均明显低于Wistar大鼠（P<0.01），说明两者均具有一定的社交障碍；而WKY大鼠与SHR大鼠社交能力无显著差异，故Wistar大鼠更适于用作SHR大鼠社交实验的正常对照组。小儿黄龙颗粒各剂量均能显著提高SHR大鼠与陌生鼠的接触时间（P<0.05），提高其社交能力。哌甲酯能不同程度地增加SHR大鼠在陌生鼠侧停留时间及时间占比，但效果不显著。
表3 小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠社交能力的影响()
注：与SHR大鼠组相比，*P<0.05,**P<0.01；与Wistar大鼠组相比，#P<0.05,##P<0.01。
Note:Compared with the SHR rat group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the Wistar rat group,#P<0.05,##P<0.01.
3.3 对ADHD模型大鼠空间记忆能力的影响
结果如表4所示，WKY大鼠与Wistar大鼠找到目标盒的潜伏期无显著差异，SHR大鼠的潜伏期低于Wistar大鼠，此现象可能与SHR大鼠多动、运动速度较快的因素有关，故潜伏期的参考意义不大。而在错误次数方面，SHR大鼠较Wistar大鼠错误次数多，提示其空间记忆能力的降低，小儿黄龙颗粒各剂量以及哌甲酯均能不同程度地降低SHR大鼠的错误次数，但差异均无统计学意义。
3.4 对ADHD模型大鼠注意定势转移能力的影响
表4 小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠空间记忆能力的影响()
注：与SHR大鼠组相比，*P<0.05,**P<0.01；与Wistar大鼠组相比，#P<0.05,##P<0.01。
Note:Compared with the SHR rat group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the Wistar rat group,#P<0.05,##P<0.01.
结果如表5所示，SHR大鼠各阶段错误率均不同程度地高于Wistar大鼠，尤其复杂辨别（CD）正向学习阶段、外维度转换（EDS）反向学习阶段差异明显（P<0.05),WKY大鼠与Wistar大鼠无显著差异，提示SHR大鼠存在注意定势转移障碍。小儿黄龙颗粒各剂量能不同程度地降低SHR大鼠各阶段的错误率，尤其在CD正向阶段、内维度转换（IDS）正向阶段、EDS的反向学习阶段作用明显（P<0.05），提示小儿黄龙颗粒可提高SHR大鼠的学习与认知能力，有效改善SHR大鼠注意定势转移障碍；哌甲酯能显著降低SHR大鼠在CD正向阶段、EDS的反向学习阶段的错误率（P<0.05）。
3.5 对ADHD模型大鼠易激惹程度的影响
结果如表6所示，SHR大鼠攻击行为总次数明显高于Wistar大鼠（P<0.01),WKY大鼠与Wistar大鼠无显著差异，提示SHR大鼠易被激怒，与临床ADHD患儿冲动、急躁易怒的行为特征相符。小儿黄龙颗粒各剂量以及哌甲酯均能显著降低SHR大鼠攻击行为总次数（P<0.05），改善其易怒特征。
3.6 对ADHD模型大鼠前额叶TH mRNA、DAT mRNA表达的影响
结果如表7所示，SHR大鼠前额叶TH mRNA、DAT mRNA的表达量明显低于Wistar大鼠与WKY大鼠（P<0.01）。小儿黄龙颗粒（1.88 g·kg-1）能显著提高SHR大鼠前额叶TH mRNA的表达（P<0.01），小儿黄龙颗粒（3.75 g·kg-1）、哌甲酯能显著提高SHR大鼠前额叶TH mRNA、DAT m RNA的表达（P<0.05）。
表5 小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠注意定势转移能力的影响()
注：与SHR大鼠组相比，*P<0.05,**P<0.01；与Wistar大鼠组相比，#P<0.05,##P<0.01。
Note:Compared with the SHR rat group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the Wistar rat group,#P<0.05,##P<0.01.
表6 小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠攻击性行为的影响()
注：与SHR大鼠组相比，*P<0.05,**P<0.01；与Wistar大鼠组相比，#P<0.05,##P<0.01。
Note:Compared with the SHR rat group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the Wistar rat group,#P<0.05,##P<0.01.
表7 小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠大脑前额叶中TH mRNA、DAT mRNA相对含量的影响()
注：与SHR大鼠组相比，*P<0.05,**P<0.01；与Wistar大鼠组相比，#P<0.05,##P<0.01。
Note:Compared with the SHR rat group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the Wistar rat group,#P<0.05,##P<0.01.
3.7 对ADHD模型大鼠前额叶DA、HVA含量的影响
结果如表8所示，SHR大鼠前额叶中DA含量低于Wistar大鼠，而HVA含量显著高于Wistar大鼠（P<0.01),WKY大鼠与Wistar大鼠间两递质含量无显著差异。小儿黄龙颗粒（3.75 g·kg-1）能显著提高SHR大鼠前额叶中DA含量（P<0.01），降低HVA含量（P<0.05）；哌甲酯能显著提高SHR大鼠前额叶中DA含量（P<0.01）。
表8 小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠大脑前额叶中DA、HVA含量的影响()
注：与SHR大鼠组相比，*P<0.05,**P<0.01；与Wistar大鼠组相比，#P<0.05,##P<0.01。
Note:Compared with the SHR rat group,*P<0.05,**P<0.01;compared with the Wistar rat group,#P<0.05,##P<0.01.

4 讨论

ADHD常伴随学习与记忆障碍、品行异常、对立违抗障碍等精神类疾病[9]，对个人成长、家庭生活和社会关系产生持久的损害，在儿科界引起了广泛重视。目前临床使用的药物大多具有潜在成瘾性，且易伴随呕吐等不良反应，而其他非药物治疗手段在实际治疗中亦存在一定的局限性，因此寻求安全、有效、绿色的治疗成为临床ADHD患者的迫切需要。近年来，国内研究发现中医药在治疗ADHD中有着显著优势，成为临床患者的新选择。
小儿黄龙颗粒作为治疗ADHD的常用中成药，方中白芍、熟地黄和麦冬共为君药，三药协同作用，起滋阴补血，安神定志，平肝潜阳的作用，能显著改善患儿多动不宁、神思涣散、性急易怒等症状[10]。鉴于小儿黄龙颗粒在治疗ADHD方面的显著疗效，故本研究拟采用ADHD大鼠作为动物模型，观察小儿黄龙颗粒对其行为学方面的干预特点，并探讨其作用机制。
本研究选取的幼年SHR大鼠为国际上应用最广泛、研究最多、较为理想的ADHD动物模型，其起源于东京远交系Wistar大鼠，是Okamoto等[11]在WKY大鼠的基础上，经过交叉培育而成，由于年幼动物常表现出多动、冲动、注意力不集中等特点，故用作研究ADHD的动物模型。实验时常将WKY大鼠作为SHR大鼠的天然对照组，但因其比其他品系大鼠自主活动低，在旷场实验中活动度下降，在水迷宫实验中易漂浮不动，表现出抑郁样的特征[12]，其行为特征与SHR大鼠的比较缺乏客观真实性，故本研究增设Wistar大鼠组，用作SHR大鼠的正常对照组。
ADHD患者存在多动、冲动、注意力不集中的症状，倾向于在工作中表现出执行障碍、内心焦虑，以及不同程度的认知障碍、学习困难和社交障碍[13]。本研究结果表明，SHR大鼠能较好地模拟临床ADHD患儿的行为学异常，小儿黄龙颗粒能显著降低其自主活动程度、提高社交能力，改善其注意定势转移障碍，并能明显缓解其急躁易怒和焦虑的状态，但对其空间记忆能力的提升作用不强。
从神经系统的解剖及功能来看，前额叶皮质与注意力的持续和调节、情绪、行为有密切关系。研究认为，ADHD潜在病理生理学机制的主要假设是基于单胺类神经功能障碍，DA作为单胺类神经中最具活性的神经递质，在前额叶皮质的功能发挥中具有重要意义[14]。在DA的合成过程中，TH是参与DA合成的起始酶和限速酶；而DAT是位于多巴胺神经突触前膜特异性的跨膜蛋白，属于Na+/Cl-离子依赖型转运蛋白基因家族，可使DA在突触扩散之前迅速灭活[15]。综上，本研究围绕多巴胺能神经通路，选取前额叶内DA及其代谢物HVA作为检测物质，并通过检测其合成与再摄取相关因子TH mRNA、DAT mRNA的表达，探究小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠的作用机制。
研究表明，SHR大鼠前额叶内DA含量较Wistar大鼠低，而HVA的含量显著升高，提示SHR大鼠存在DA的合成与代谢紊乱，多巴胺能神经失调，进而影响其注意力、情绪和行为，与前面SHR大鼠行为异常的结果吻合；进一步的研究表明，SHR大鼠前额叶内TH mRNA、DAT mRNA表达较Wistar大鼠显著降低，故造成DA的合成障碍以及再摄取异常，与神经递质的检测结果一致。小儿黄龙颗粒能显著提高前额叶TH mRNA的表达，增加DA的合成；并通过提高DAT mRNA的表达，实现突出前膜对DA的再摄取，从而增加前额叶DA含量，降低HVA含量。

综上，小儿黄龙颗粒对ADHD模型大鼠的行为学异常具有明显的改善作用，其作用机制与其能提高前额叶TH mRNA、DAT mRNA表达，进而提高DA含量，降低HVA含量，改善多巴胺能神经功能相关。

参考文献
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